Biokatalytische Fixierung von CO2 zur Synthese von L-Methionin

Von Julia Martin, Lukas Eisoldt & Arne Skerra

Laut einer Studie zur Entwicklung der Weltbevölkerung wird diese von 7,6 Milliarden im Jahr 2017 auf ca. 9,8 Milliarden bis 2050 anwachsen [1]. Um den ständig steigenden Bedarf an Nahrungsmitteln zu decken, wird seit den 1950er Jahren versucht, die Tierzucht durch Supplementierung konventioneller Futtermittel mit Aminosäuren wie D/L-Methionin (D/L-Met) effizienter zu gestalten [2]. Solche essentiellen Aminosäuren müssen von Vertebraten, darunter dem Menschen, mit der Nahrung aufgenommen werden. Nach dem Minimumgesetz von Justus von Liebig limitiert die knappste Ressource (insbesondere D/L-Met) das Wachstum, so dass andere Futtermittelbestandteile, die im Überschuss vorhanden sind, ungenutzt ausgeschieden werden. Durch die selektive Supplementierung steigt also die Gewichtszunahme pro kg Futtermittel.

Industriell wird jährlich mehr als 1 Mio. Tonnen D/L-Met durch chemische Synthese hergestellt [2]. Der mittlerweile hervorragend optimierte Prozess ist jedoch auf die stark toxische Substanz Cyanwasserstoff (HCN) als Reaktionskomponente angewiesen. Dies erfordert hohe Sicherheitsmaßnahmen, weshalb Evonik Industries im Rahmen einer Ausschreibung im Jahr 2013 nach einem HCN-freien Prozess ausgehend von dem leicht verfügbaren Vorläufer-Aldehyd Methional suchte. Neben zwei chemischen Lösungsansätzen wurde die Idee von Prof. Dr. Arne Skerra einer zweistufigen bio-katalytischen Synthese prämiert und im Rahmen einer Kooperation gefördert.

Biokatalytische CO2-Fixierung in L-Methionin

Abbildung 1: Zweistufige biokatalytische Synthese von L-Met aus Methional über 4-Methylthio-2-oxobutansäure (MTOB). MTOB entsteht als Intermediat nach der Carboxylierung von Methional durch die Decarboxylase KdcA. Anschließend wird diese α-Ketosäure entweder durch die Aminotransferase YbdL oder die Aminosäuredehydrogenase LeuDH zu L-Methionin umgesetzt.
Abbildung 1: Zweistufige biokatalytische Synthese von L-Met aus Methional über 4-Methylthio-2-oxobutansäure (MTOB). MTOB entsteht als Intermediat nach der Carboxylierung von Methional durch die Decarboxylase KdcA. Anschließend wird diese α-Ketosäure entweder durch die Aminotransferase YbdL oder die Aminosäuredehydrogenase LeuDH zu L-Methionin umgesetzt.

Gemäß diesem innovativen Konzept sollte in der ersten Reaktion der aliphatische Aldehyd Methional mit Hilfe einer Decarboxylase (z.B. KdcA aus Lactococcus lactis) carboxyliert werden. Dieser Schritt gilt unter physiologischen Bedingungen eigentlich als irreversibel (offenbar aufgrund des geringen atmosphärischen CO2-Partialdrucks von 0,04 %, wie unsere Ergebnisse später zeigten). Im zweiten Schritt sollte die entstandene α-Ketosäure (4-Methylthio-2-oxobutansäure, MTOB) stereospezifisch entweder von einer Transaminase (z.B. YbdL aus Escherichia coli) oder einer Aminosäuredehydrogenase (z.B. LeuDH aus Lysinibacillus sphaericus) zu L-Met aminiert werden. Dieser Syntheseweg basiert quasi auf einer Umkehrung der vor allem aus Hefen bekannten Aminosäuregärung [3].

Zunächst konnten wir experimentell demonstrieren, dass dieses Konzept trotz des ungünstigen chemischen Gleichgewichts der ersten Reaktion zur Synthese von L-Methionin genutzt werden kann. Durch Optimierung der Reaktionsbedingungen gelang es uns, die Ausbeute der gekoppelten Reaktion mit der Decarboxylase und Transaminase von anfänglich 3 % auf 40 % zu steigern. Wegen des hierbei äquimolaren Verbrauchs des an sich wertvollen Aminogruppendonors L-Glutamin ersetzten wir zur ökonomischen Verbesserung des biokatalytischen Synthesewegs die Transaminase durch die Leucin-Dehydrogenase, welche einfachen Ammoniak als Stickstoffquelle verwendet [4]. Das Recycling des dabei benötigten Cofaktors NADH sollte in vitro wie auch in vivo mit etablierten Verfahren umzusetzen sein [5].

Im Fokus unserer Forschung stand neben der enzymatischen Methionin-Synthese das Verständnis der unter physiologischen Bedingungen als irreversibel geltenden Decarboxylierung. Mit Hilfe der Haldane-Beziehung, die die Berechnung des chemischen Gleichgewichts aus den kinetischen Parametern für die Hin- und Rückreaktion eines Enzyms mit bekanntem Reaktionsmechanismus erlaubt, konnten wir diesen Wert erstmals bestimmen. Wie erwartet lag die Gleichgewichtskonstante mit 1/16.5 kbar weit auf der Seite der Decarboxylierung. Da CO2 bei dem entsprechenden Gleichgewichtsdruck bereits als Feststoff (Trockeneis) vorläge, kamen uns die überraschend hohe Substrat-Affinität der KdcA für CO2 (KM = 3,3 bar) und das Prinzip von Le Chatelier zu Gute. Durch Kopplung des ungünstigen chemischen Gleichgewichts der Carboxylierung mit der energetisch favorisierten Aminierung als Folgereaktion genügte tatsächlich 2 bar CO2 für eine effiziente Methionin-Synthese [4].

Abschließend konnten wir zeigen, dass sich mit denselben Enzymen (KdcA & LeuDH) bei Einsatz der entsprechenden Aldehyd-Subtrate auch L-Leucin und L-Isoleucin synthetisieren lassen [4]. Zudem konnte unter Verwendung einer D- bzw. L-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase als Zweitenzym das ebenfalls als Futtermittel verwendete Methionin-Hydroxyanalogon (MHA) hergestellt werden [6].

Der HCN-freie enzymatische Syntheseweg für Aminosäuren gestattet im Prinzip auch den Zugang zu anderen wertvollen Produkten bei verminderter Toxizität, beispielsweise pharmazeutischen Wirkstoffkomponenten. Zudem eröffnet die hier erstmals praktisch demonstrierte Umkehrung einer Carboxylase-Reaktion – mit ihren vielen Erscheinungsformen in diversen Wegen des Primär- und Sekundärstoffwechsels – eine innovative biosynthetische Route, über die pflanzliche Photosynthese hinaus, zur industriellen Nutzung des klimaschädlichen Treibhausgases CO2.

Literatur

[1] https://population.un.org/wpp/Publications/Files/WPP2017_KeyFindings.pdf (Stand: 6.11.2018)

[2] Willke, T. (2014) Methionine production – a critical review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 9893-9914.

[3] Hazelwood, L.A., Daran, J.-M., van Maris, A.J.A., Pronk, J.T. & Dickinson, J.R. (2008) The Ehrlich Pathway for Fusel Alcohol Production: a Century of Research on Saccharomyces cerevisiae Metabolism. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2259-2266.

[4] Martin, J., Eisoldt, L., Skerra, A. (2018) Fixation of gaseous CO2 by reversing a decarboxylase for the biocatalytic synthesis of the essential amino acid L-methionine. Nat. Catal. 1, 555-561.

[5] Wichmann, R., Wandrey, C., Bückmann, A.F. & Kula, M. (1981) Continuous enzymatic transformation in an enzyme membrane reactor with simultaneous NAD(H) regeneration. Biotechnol. Bioeng. 23, 2789-2802.

[6] Skerra, A., Martin, J., Jakob, H. & Fischer, D. (2018) Enzymatic method for producing 2-hydroxy-4-methylmercapto-butanoic acid (mha). EP 3388523 A1.

[7] https://corporate.evonik.com/misc/micro/methionine/methionin_en.html (Stand 26.11.2018)