Die Entschlüsselung des Proteinabbau-Codes
Ubiquitin markiert Proteine für den Abbau, wobei Ubiquitin-Moleküle in unterschiedlicher Art und Anzahl kombiniert sein können und unterschiedliche Ketten bilden. Forschende des Max-Planck-Instituts für Biochemie (MPIB) haben die neue Technologie UbiREAD entwickelt, um die verschiedenen Kombinationen der Ubiquitin-Moleküle – den Ubiquitin-Code – zu entschlüsseln, der bestimmt, wie Proteine in Zellen abgebaut werden. Mit UbiREAD markieren die Forschenden fluoreszierende Proteine mit spezifischen Ubiquitin-Kombinationen und verfolgen deren Abbau in Zellen. Die in Molecular Cell veröffentlichte Studie zeigte, welcher Code den intrazellulären Proteinabbau auslösen kann und welcher nicht. Die Studie zeigte auch, dass der Proteinabbau in Zellen schneller als im Reagenzglas ist, und fand eine molekulare Hierarchie innerhalb der Ubiquitin-Ketten.
Proteine sind die Bausteine des Lebens und erhalten die Zellstruktur und ‑funktion aufrecht. Wenn Proteine jedoch beschädigt, falsch gefaltet oder ausgedient haben, können sie zu einer Reihe von Krankheiten führen, von Alzheimer und Parkinson bis hin zu Krebs und Muskeldystrophie. Um dies zu verhindern, haben Zellen ein ausgeklügeltes System entwickelt, um unerwünschte Proteine mit einem kleinen Protein namens Ubiquitin für den Abbau zu markieren.
Ubiquitin-Ketten
Ubiquitin ist eine zelluläre Markierung, die festlegt, was mit einem Protein geschehen soll. Der Ubiquitin-Code kann aus einem einzelnen Ubiquitin-Kennzeichen oder aus mehreren Ubiquitinen bestehen, die miteinander verbunden sind. Leo Kiss, Erstautor und Postdoktorand in Brenda Schulmans Abteilung Molekulare Maschinen und Signalwege am MPIB, erklärt: „Der Ubiquitin-Code ist aufgrund seiner Komplexität faszinierend: Die Verknüpfung eines Ubiquitin-Moleküls mit einem anderen kann auf acht verschiedene Arten erfolgen. Diese Verknüpfungen können sich mehrfach wiederholen und Ketten unterschiedlicher Länge bilden. Und als ob das nicht schon komplex genug wäre, können sich verschiedene Arten von Ketten verzweigen. Bei so vielen Möglichkeiten verstehen wir die Informationen, die diese Strukturen kodieren, noch nicht vollständig. Hier kommt unsere Technologie UbiREAD ins Spiel – sie funktioniert wie ein Scanner, der entschlüsseln kann, was diese verschiedenen Ubiquitinketten in den Zellen bewirken.“
Wie der Ubiquitin-Code analysiert wird
Die Komplexität des Ubiquitin-Codes stellt für Forschende, die sich mit dem Proteinabbau befassen, eine große Herausforderung dar. Die verschiedenen Kombinationen von Ubiquitinkettentypen, ‑längen und ‑formen führt zu einer Vielzahl von Codierungen, die sich nur schwer entschlüsseln lassen. Eine der größten Hürden war das Fehlen eines systematischen Ansatzes zur Beobachtung des Proteinabbaus in Zellen. Die derzeitigen Methoden weisen Einschränkungen auf: Während zellbasierte Ansätze keine spezifischen Ubiquitinketten in Zellen nach Bedarf erzeugen können, gelingt es mit biochemischen Methoden oft nicht, das in Zellen beobachtete Abbauverhalten nachzubilden. Dies hat zu widersprüchlichen Ergebnissen in verschiedenen Studien geführt.
UbiREAD-Technologie
Um den Ubiquitin-Code zu entschlüsseln und den Proteinabbau besser zu verstehen, hat Leo Kiss in Zusammenarbeit mit Leo James, Leiter der Forschungsgruppe „Host-Pathogen Biology“ am MRC Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, Großbritannien, UbiREAD entwickelt, engl. Ubiquitinated Reporter Evaluation After intracellular Delivery (dt. Ubiquitinierte Reportermessung nach intrazellulärer Verabreichung). Dieser neue Ansatz ermöglicht die Untersuchung des zellulären Abbaus von Proteinen, die einen definierten Ubiquitin-Code tragen. Die Forschenden markieren ein fluoreszierendes Protein mit einem bekannten Ubiquitin-Code. Anschließend geben sie das markierte Protein an die Zellen ab. Anhand der Fluoreszenzintensität, die mit der Menge der Proteine korreliert, können sie das Schicksal des Proteins verfolgen: Wenn es noch intakt ist, bleibt die Fluoreszenz bestehen, wenn es abgebaut wird, geht die Fluoreszenz verloren.
Mit UbiREAD entdeckten die Forschenden, dass der intrazelluläre Abbau schneller ist als der Abbau desselben Proteins in einem Reagenzglas mit aufgereinigten Abbaumaschinerien. Es dauert nur eine Minute, um die Hälfte des markierten Proteins in der zellulären Umgebung abzubauen. Außerdem konnten sie zeigen, dass Proteine, die mit einer bestimmten Art von Ubiquitinkette, der sogenannten K48, markiert sind, schnell abgebaut werden, während Proteine mit K63-Ketten schnell ihre Markierung verlieren und nicht abgebaut werden.
Die Forschenden verglichen auch verschiedene Längen von Ubiquitinketten. Leo Kiss sagt: „Überraschenderweise, reichten Ketten mit bereits drei Ubiquitinmolekülen aus, um das fluoreszierende Protein effektiv abzubauen. Dieser Code kann jedoch verloren gehen, wenn diese Ubiquitine nicht direkt auf dem Protein, sondern auf einer anderen Ubiquitinkette angeheftet werden. Es kommt auf den genauen Kontext an.“
Brenda Schulman, Direktorin am MPIB, fasst zusammen: „Unsere Ergebnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, Ubiquitinketten und ihre Funktionen in ihrer natürlichen zellulären Umgebung zu untersuchen. Wir haben gezeigt, dass UbiREAD ein vielseitiges Werkzeug ist, um den intrazellulären Abbau von Proteinen zu analysieren, die an verschiedene Arten von Ubiquitin oder Ubiquitin-ähnlichen Proteinketten in unterschiedlichen zellulären Kontexten gebunden sind. Auch in Zukunft werden wir UbiREAD einsetzen, um in naher Zukunft noch viele weitere Erkenntnisse über das komplexe Ubiquitinsystem zu gewinnen.“